唐氏症的挑戰

 

臺灣大學  謝豐舟教授

　　

唐氏症是最常見的染色體異常，它是智障（mental retardation）的主要原因，約占其三分之一。

　　　　　　　　　　

　　　　

唐氏症這種疾病之被確認已達150年，它也是第一個基因體變化被確定的先天性缺損─多出了一個21號染色體，因此亦稱為「21號三染色體症」（Trisomy21）。雖然醫學界對於它的基因體變化已經知道多年，但迄今學者仍然無法解釋為什麼多了一個21號染色體，就會造成唐氏症。更具挑戰性的是，儘管基因體的變化都是多了一個21號染色體，但唐氏症患者個別的症狀表現卻有相當大的變異，到底其中的分子機轉如何？

　　　　　　　　　　

 

 

基因體醫學研究的基本原則其實是將基因型（genotype）與表現型（phenotype）仔細比對，希望從而找出基因型的意義。在種種疾病中，以癌症、糖尿病、高血壓為例，其基因型並不清楚，故而要與表現型比對，有其基本的困難。但是在唐氏症，其基因型非常清楚—就是多了一個21號染色體；其基因型也容易掌握，它應該是連結基因型與表現型最好的模式。因此，近來國際學界又開始了唐氏症研究的熱潮。

 

 

►唐氏症致病機轉仍成謎

學者推想唐氏症多了一個21號染色體，可能會有下列後果：

一、唐氏症的形成應該是21號染色體上的許多基因造成，但到底多少個基因參與則毫無頭緒。2003年，21號染色體定序完成，其上有約200個基因，但到底有多少基因真正造成唐氏症，則有二種看法：有人認為是由具有主要表現型效果的少數幾個基因造成；有人則認為是由各具適度表現型效果的許多基因造成。由目前動物模式的研究來看，似乎以前者較為可能。

二、唐氏症是因為基因劑量（gene dosage）的異常所致。這些基因本身沒有突變，基因產品正常的，只是產量不對，因此唐氏症的遺傳學變化是在量而不在質。由於21號染色體由二條增為三條，因此最直接的推測是基因表現量會增加50％。目前的研究似乎也證實了這種推測。接下來的問題就是：何以這種看來不怎麼大的增加會造成如此厲害的變化？

三、21號染色體上一些具有功能的非編碼蛋白質用的DNA（non-protein-coding DNA elements），其多出的一份複製（copy）可能也與某些不正常表現型的形成有關。從比較分析上可以發現這些非編碼區域在脊椎動物均是conserved，也就是必然有其功能性。因此這些非編碼蛋白質用的 DNA可能也對唐氏症的致病機轉有所關連。

唐氏症的表現性隨個人而異，也隨著年齡而變化（表1）。目前雖然對其致病機轉所知不多，不過已有一些進展。唐氏症特有的顱顏部變化可以在既存的唐氏症小白鼠模式Ts65Dn及Ts1Cje重現。近來的研究更顯示兩個基因DYRKIA（dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1A）以及DSCR1（Down syndrome critical region 1）可能與唐氏症的顱顏變化，還有心臟、腸胃以及免疫學的變化有關。這些基因似乎與NFAT（nuclear factor of activated T cells）─calcineurin系統有關，此一系統會將Ca⁺⁺訊號傳遞到細胞核。

                  

 

 

►中樞神經系統

唐氏症患者的中樞神經系統終身都受到多出一個21號染色體的影響。除了某種程度的小腦發育不良（hypoplasia），唐氏患者症的腦子外觀上並無異常。唐氏症出生就有中樞性的低緊張度（hypotonia），這是唐氏症最常見的表徵。接下來在嬰兒期與兒童期會有延遲的認知發育，導致輕度到中度智障，成年期則見認知能力的喪失，後期則發展成阿茲海默症（Alzheimer disease）。事實上，澱粉質蛋白（amyloid protein）的沈積在十幾歲時已經開始，阿茲海默症的全面出現從35歲開始，比一般人早了50年。除了澱粉值前驅蛋白（amyloid precursor protein, APP），presenilin 1、presenilin 2基因的突變者之外，只有唐氏症會有發生早期阿茲海默症的100％ 風險。對基因劑量假說的一項有力證據是在APP基因內一段0.5 Mb的複製（duplicate）就會造成唐氏症，尤有進者，啟動因子（promoter）發生會增加APP表現的突變也會造成唐氏症。

唐氏症患者的認知障礙在智力功能的各方面並不一致。患者在智力有強有弱，依靠海馬迴的學習功能最受影響。額葉前區皮質（Prefrontal cortex）以及小腦功能亦受影響，言語（speech）與發音（articulation）的影響極為明顯。

許多解剖、生化及生理研究對唐氏症患者認知障礙成因的了解並沒什麼助力。幾年前，學者發現唐氏症患者神經元的樹狀突棘（dendrite spine）有形態上的異常，此處是一突觸（synapsis）形成的地方。此一發現原來被認為沒什麼意義，然而最近因為Ts65Dn的腦中也有此一現象，重新受到注意。Ts65Dn小白鼠的海馬迴神經元在長時程增強（long term potentiation, LTP）及長時程抑制（long-term depression, LTD）方面均有顯著異常。LTP與LTD是與記憶和學習有關的電生理現象。唐氏症患者腦中類似的現象將可以增進我們對認知障礙的了解，而且可能成為一個臨床標的。另外在Ts65Dn小白鼠腦中還有一個與人類有關的變化：前腦基底區的膽鹼能神經細胞（basal forebrain cholinergic neuron）逐漸的喪失和萎縮，此一細胞群在阿茲海默症特別脆弱。

 

 

►免疫與造血系統

　　儘管各方面的進步，感染仍是唐氏症的主要死因之一。有人認為此肇因於胸腺的不正常成熟與T淋巴球功能的降低，其中可能與前述DYRKIA與DSCRI基因有關。最令人注目的是，唐氏症嬰兒發生白血病，特別是急性巨核胚細胞白血球病（acute megakaryobastic leukemia, M7）的高比率，幾為正常人的20倍。此病常以新生兒的白血病樣反應（leukemoid reaction, transient myeloproliferative disorder）為先兆。有個獨特的GATA 1（GATA binding protein 1）基因被發現與白血病白血病樣反應有關。急性巨核胚細胞白血球病的患者中，唐氏症者的預後較非唐氏症者較佳，且需要的化療較少。

 

 

►表現型變異（Phenotypic variability）

唐氏症的各種表現型幾乎都有極高的變異度（high degree of variability）。微細的變形特徵（minor dysmorphic features）沒有一個的存在會超過80％，而任何兩個唐氏症患者其各種變異的組合也絕不相同。然而唐氏症整體的形態，雖然受到家族因素的影響，仍然相當恆定與特別。足以提供臨床診斷之用。先天性心臟病是唐氏症的特徵，它可以從心房中膈缺損，心室中膈缺損到完全的房室缺損（complete atrioventicular-canal defects），不過只見於唐氏症兒的50％。相同的，腸胃道的異常，特別是十二指腸狹窄（duodenal atresia），也是唐氏症的特徵，但只見於4～5％。

　　唐氏症的認知發育也是變異極大。不管是發育指標達成的時間，或是最後達到的功能層面都有很大的個人變異。當然兩者可能也跟後天環境因素有關。年齡大的唐氏症患者有相當可觀的部分發生阿茲海默症。過去20年，唐氏症患者的壽命中位值在白種人中增加了兩倍（1997年達到50歲），但在其他族群由於環境的差異，卻未達到這樣的水準。

 

 

►唐氏症患者的需求

　　唐氏症患者需要有效的方法，治療及策略來改善他們的認知、語言、發音，防止認知能力的退化及阿茲海默症，改善免疫功能及預防白血病。過去，由人類及動物模式的分子遺傳學以及基因體學的研究提供了不少希望，動物模式研究的最大課題是解析唐氏症的分子、細胞以及功能異常以建立動物模式與人類情況的相關性。雖然目前有幾種三種染色體老鼠（trisomic mouse）具有唐氏症中樞神經系統的表現型，但目前尚未能將海馬迴突觸功能的異常或前腦基底區的膽鹼能神經細胞內神經生長因子的傳輸從小白鼠研究轉譯到人類。

　　要了解唐氏症患者在認知、阿茲海默症、白血病、壽命的表現型變異性是研究者的一大挑戰，不過如果能夠了解這些因素，不僅對唐氏症患者症狀的預防治療有所助益，更將使我們對基因體的系統性調控有更深入的掌握。

 

 

►目前的治療性臨床實驗

當前唐氏症研究是基於下列前提：在基因及分子層面了解唐氏症的機轉，將可以提供一個發現預防及治療方法的理性基礎（rational basis）。這種想法的一個原則性證明（proof of principle）可以從近來的實驗發現Ts65Dn小白鼠小腦神經元數目的減少，在人類唐氏症小腦也可發現，而Ts65Dn小腦神經元數目的減少可以藉SAG1.1的治療加以矯正。SAG1.1是sonic hedgehog pathway（會引導胚胎各個部位會發展成不同功能的細胞）活性的促效劑（agonist）。

除了這種機械式的策略之外，也可以不從基因、分子方面切入。我們也可以從表現型異常本身以及目前存在的潛在性有效治療藥物兩方面著手。這種方式也許可以用來應付唐氏症患者的阿茲海默症。因此，種種治療性的試驗也許不一定要基於準確的基因機轉，但還是需要先有理性的基礎。迄今許多立意良好的臨床試驗，例如營養補充和piracetam（一種大腦增進劑）都只是經驗之談而缺乏理性的基礎，以致結果不出所料地令人失望。

 

 

►21號染色體序列及變異（Genes & Pscudogenes）

　　要了解唐氏症當然必須了解21號染色體上的功能性DNA序列。2003年21號染色體（HSA21）的長臂（21q）幾近完全的高品質序列正式發表。這是第一個被定序完成的人類染色體。21q的長度為33.6Mb，約為人類全部真染色質基因組序列（euchromatin genome sequence）的1％，不過中心粒附近以及短臂（21p）大部份的DNA序列仍未知曉。目前只有21p的5～15Mb中的一小段（281Kb）已被定序，國際間正合力來揭曉21p的DNA序列（以及其他areocentric chornssane的短臂）。學者預測21p的定序難度甚高，這是因為21p的反覆單元（repetitive element）以及它們的複製數量多樣性（copy number polymorphism）使定序工作相當不易。

　　21q上的基因目錄到目前為止仍不完整，蛋白質編碼基因（protein-coding gene）的數目估計為271～364，隨不同的資料庫（database）而異（www.ensembl.org, www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSef/）。這些估計都是以運算方法為基礎，不過expressed sequence tag (EST) sequencing, comparative genomic analysis以及laboratory verification都可能造成低估，因為single-axon protein-coding genes以及non-coding RNA分子極難辨識及定性。近來對21q整體的轉錄活性分析顯示：潛在性的轉錄序列可能10倍於目前已經定義的基因（The potentially transcribed genome is about 10-fold larger than the current genie annotation）。此證據揭示了今後數年在non-protein-coding RNA分子方面將有重要的發現，舉例而言，運算分析初步顯示21q至少有5個micro RNA分子，而且眾所周知，21q有40～50 copy的DNA 基因。21q上有許多假基因已被確認，數目估計在83～149。

　　因此21q上的基因定義仍有待完成，更進一步而言HSA21 transcripts與唐氏症的分子機轉仍然無法連結。

 

 

►比較基因體分析顯示演化保留的non-coding sequence

　　比較人類與其他哺乳類的基因體（尤其是小白鼠）導致許多高度保留序列的發現，他們正是non-protein-coding gene所在。將21q的33.6Mb與orthologous mouse genomic regions（在老鼠的第10、16、17對染色體）做序列比對，學者發現了高達2,000處，長度100 base pair以上，且相似度70％以上的區段，這些single copy的序列被稱為CNG（conserved non-genic）、CNC（conserved non-coding）或MCS（multiple conserved sequences），而且多半位於21q上基因較少的區段。它們約占21q的1％，功能上未轉錄（not functionally transcribed）。這些序列大約80％是在基因間隔部位（intergenic region），20％位於introns。多數的CNG在哺乳類高度保留，從靈長類（primates）到單孔動物（monotremes）到有袋類（marsupials）均見存在，大約有10％可見於雞的基因體。橫跨三億年的保留顯示這些CNG很可能有其功能，部份CMG可能為cis-acting轉錄調控者，亦有可能為trrans-acting轉錄調控者或是染色質（chromatiin）的結構元素，也有可能它們的功能是迄今全無所知的新作用。雖然CNG與唐氏症的關係一無所知，不過它們是有趣的研究對象。因為有人在小白鼠7號染色體上的一個CNG引發複製，就產生了可以辨認的表現型─多指症。

 

 

►序列變異

　　人類個體之間的DNA序列其實有極大的變異性。對唐氏症患者21號染色體的三個copy研究對偶基因組成（allele composition），可能有助於了解唐氏症表現型的成因。對偶基因變異性（allele variability）可能是基因表現在量方面的差異，以及蛋白質結構與功能在質方面的差異的分子基礎。進一步而言，對偶基因變異性可能是造成唐氏症患者表現型個別差異的原因。在公共資料庫中已有超過137,000可能的HSA21 SNPs（single nucleotide polymorphism, 單體核甘酸多樣型）被登錄，其中約有1,130個SNP被預測會造成氨基酸取代，而640個會導致non-synonymous change。此外，相當數目的SNP可能與cis或trans-acting基因的表現有關。另外，21q的1.26％為short sequence repeats，這些short sequence repeats亦可能為多型(polymorphic)。

 

►Trisomy 21的基因表現差別及變異

　　由於第21號染色體（trisomy 21）是複製數量（copy number）的異常，學者對它與正常情況之間的基因表現差異自然大感興趣。他們使用微陣列（micnoarrary）、基因表現連續分析（serial analysis of gene expression, SAGE）或差異顯像（differential display PCR）來加以探討。起初的基因轉錄體學（transcriptome）分析利用enploid及trisomy 21的人類羊膜穿刺（human amniocytes）、星狀膠細胞株（astrocyte cell lines）以及冷凍人類大腦（frozen human brain）。此外，小白鼠的大腦、小腦、神經球以及細胞株標本也被用來比較segmental mouse trisomy 16以及euploid littermates的基因轉錄體學差異。以上研究多顯示大部份upregulated基因都來自HSA21（或是從orthologous regions on mouse genome）而downregulated 基因則見於整個基因體。後續的整合分析（metaanalysis）將可以找出這些分析真正的生物學意義，並找出致病機轉的假說以及潛在的治療方式。

　　學者曾利用real-time定量PCR來精確測量小白鼠模式的轉錄定量以評估HSA21 gene mouse orthologs 的過度表現情況。令人驚訝的是，在各種小白鼠組織中，只有37％基因的表現達到理論上的1.5倍於正常組，其他基因的表現則是與正常組無異或是介於1～1.5倍之間。其他微陣列及定量PCR的分析則顯示接近於1.5倍的表現量。當然這需要進一步研究來釐清這些差異，不過，這些資訊已經顯示基因劑量不平衡（genomic dosage imbalance）會導致基因表現複雜的調控，這將有助於辨識白鼠模式中引起唐氏症表現型的基因。 trisomy 21 的基因轉錄體學分析及其生物學意義的探討在往後數年勢將深受學界關注。學者必須利用現有及將來的唐氏症小白鼠模式。去觀察不同發育階段的各種細胞的基因表現，當然相關蛋白質的研究也是必須的。

 

 

►個體基因表現的變異

　　近來對從不同個體得到的不同細胞株所做的研究，顯示基因表現有極大的變異性。此外，有幾個研究也證明基因表現的對偶基因不平衡（allele imbalance, 亦即一個基因的兩個對偶基因表現量不同）。此種對偶基因不平衡可能與唐氏個體表現型的變異有關。我們可以設定一個假說：當一個基因的總體轉錄（total transcript）或蛋白質產量必須達到某一閥值（threshold），唐氏症表現型才會出現，否則就不會有唐氏症的表現型。在適當的細胞中去探討轉錄基準（transcript level）與唐氏症表現性出現與否的相關性研究，是證實或否定此一假說所迫切需要的。進一步而言，證據顯示基因表現的變異是受制於cis及trans-genetic variation。兩個最近的研究證實了幾個21號染色體上的基因有cis-regulatory variation。由以上證據我們可以相信：這些基因體的變異可能導致allele-specific trisomic features以及某些唐氏症表現型的變異性，若能發現將可以決定cis-genes trancript level的HSA21基因，將有助於預測唐氏症的表現型變異性。

 

 

►ENCODE計畫

　　ENCODE是個國際合作的前導計劃，它針對44處選定基因組區（selected genomic regions）去辨認其功能單元（functional elements）。這44區約占人類基因體的1％，其中的兩區，ENm 005（1.7Mb）以及ENr 133（0.5Mb）是在21號染色體上（http://gemome.ucsc.edu/ENCODE/encode.hg17.htme）。此一計畫將有助於辨識功能性元素，此一計畫使用:

一、computation and experimental approaches to identify all genes and transcript.

二、Extensive sequencing of model organisms to identified conserved functional elements.

三、Experimental characterization of gene regulatory regions and chromatin structural features.

四、Sequencing and genotyping of several individuals to characterize the neural and functional variation.

以上這些資訊對了解唐氏症的分子致病機轉至為重要。

 

 

►小白鼠模式

　　小白鼠模式將是許多未來研究不可缺少的資源，由於小白鼠基因序列已知，所以可以產生segmentally trisomic mouse而且具有界限準確的tripliccated region。

　　Ts65Dn與Ts1Cje segmental trisony 16白鼠已經提供辨認唐氏症表現型的大好機會，特別是在CNS方面。最近有另外兩個新模式被引進，一個是Ts1Rh，它是segmentally trisomic for the DSCR。另外一個是transchromosomic mouse Tel；其中帶有人類染色體所有基因的一個copy，連同該老鼠本身就有的兩個copy，此種trisomic-diploid mosaics與唐氏症有各種表現型相似性，包括先天性心臟病，這在其他模式從未出現。利用對白鼠及人類基因體的知識，我們可以創造其他的transgenic models，其中個別基因的copy數目可以視需要增加以供特定課題的研究

 

 

►唐氏症治療的前景

　　目前對唐氏症的致病機轉所知有限，必須再經過多年的研究才可望了解，並設計治療方法。基因以及其他conserved DNA elements的功能性分析以及其調控是研究的兩大基石。最近micro DNA或SiRNA的發現提供了矯正唐氏症不正常基因表現的可能性，也許我們對唐氏症患者的前景，可以稍感樂觀。

　　筆者從事醫學遺傳學30年，出發點就是唐氏症的產前診斷。從羊膜穿刺、羊水細胞檢查、超音波檢查、絨毛採樣、胎兒採血以至母血唐氏症篩檢，今天讓臺灣的唐氏症問題在產前方面已經得到相當徹底的解決。然而，每年還是會有一些唐氏兒出生，加上過去已經出生的病患，唐氏症患者的醫療與照顧仍然值得我們繼續關注。

新的醫療與照顧必然來自繼續的研究，因此前述國際學界對唐氏症重燃研究熱誠，自是好事一樁。筆者最近也重起爐灶，利用新的工具（如生物晶片），重新檢視唐氏症。筆者與碩士班學生周靜玉醫師利用生物晶片檢查唐氏症羊水細胞的基因表現，發現確實有一組表現量變異大的基因。這可能是唐氏症基因表現dysregulation的表徵，也許就是前述唐氏症表現型變異度大的原因。另一位碩士班學生蕭勝文醫師，則藉由檢查21p上兩個已知基因的複製數量來探討轉位性唐氏症。近來神經科學的研究風起雲湧，配合前述的基因及分子研究，相信有助於了解唐氏症智障之機轉。相信這也將有助於揭開人類智力的神祕面紗。

          

 

取材文獻

1.     Epstein CJ et al: The challenge of Down syndrome. Trends in Molecular Medicine 12:473, 2006.

2.     Hsieh FJ et al: The evolving national birth prevalence of Down syndrome in Taiwan. A study on the impact of second-trimester maternal serum screening. Prenat Diagn. 25(8):665, 2005.

3.     Hsieh FJ et al: Maternal serum screening for down syndrome by using alpha-fetoprotein and human chorionic gonadotropin in an asian population. a prospective study. Fetal Diagn Ther. 15(2):108, 2000.

4.     Down syndrome screening in an Asian population using alpha-fetoprotein and free beta-hCG: a report of the Taiwan Down Syndrome Screening Group.Obstet Gynecol. 87(6):943, 1996.

5.     Hsieh FJ et al: Prenatal cytogenetic diagnosis in amniocentesis. J Formos Med Assoc 91(3):276, 1992.