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閒話基因體科學_21.分子神藥Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor的發展史
by 陳怡蓁, 2012-08-21 13:49, Views(7792)

分子神藥

Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor的發展史

 

臺大醫學院  謝豐舟教授

 

傳統的癌症治療藥物基本上都是針對癌細胞進行細胞分裂的比例較正常細胞為高的特性,進行所謂「cytotoxic」的治療。這些治療藥物基本上也都是mitogen,在殺滅癌細胞的同時,也促進癌細胞的突變,產生了具有抗藥性的細胞,終至無法收拾。這是當代癌症治療的致命傷。因此,追求利用不同機轉的治癌藥物一直是醫學界努力不懈的目標近年來針對癌症血管而發展出來的抗血管新生(antiangiogenesis)藥物就是一種嘗試。

另外一個方向就是針對癌細胞特有的分子機制而發展出特別的藥物,這就是所謂「針對性治療」(targeted therapy)。近年來,經過多年的摸索,終於在targeted therapy方面有了顯著的突破,那就是針對慢性骨髓性白血病的ImatinibGleevec, ST1571, Norvatis),針對乳癌的TrastuzumabHerceptin, Genentech)以及最近大出風頭針對非小細胞肺癌的GefitinibIressa, ZD1839, AstraZeneca)。基本上這些治癌的神奇藥物(magic drug)都是針對上皮生長因子受器(Epidermal growth factor receptor, EGFR)而發展出來的藥物,因此本文就從EGFR的發展史切入,來探討這些神奇藥物。

1952Rita Levi-MontalciniViktor Hamburger的實驗室中發現小鼠腫瘤細胞會分泌一種因子可以強力促進雞胚胎內神經突(neurite growth)的生長。Levi-Montalcini以及Stanley Cohen1957年由蛇毒以及小鼠唾液腺中分離出此一因子,命名為nerve growth-factor NGF)。1962年由唾液腺中又分離出另一種蛋白質,將之注射於新生小鼠會提早使其張開眼瞼和長出牙齒,並命名為上皮生長因子(epidermal growth factor, EGF),因為它能促進上皮細胞的繁殖。1986Levi-MontalciniCohen因為NGFEGF的發現而獲得諾貝爾生理及醫學獎。

1975Graham Carpenter125I標記EGF以及來自不同物種的纖維母細胞,證明在這些細胞表面有EGF特定的結合位置,也就是其受器(receptor)-EGRF1978Cohen鑑定出EGFR是一個170-Dka的細胞膜成份。當以EGF處理A-431 epidermoid carcinoma cells時,EGFR會吸收更多的32P。當時大家就推測細胞膜成份或細胞膜蛋白質的磷酸化可能是產生節制細胞繁殖所需細胞內訊號的重要關鍵。1979年在腫瘤病毒的研究證明了EGFRtyrosine residue因磷酸化而發生改變。HunterSefton1980年證明Rous sarcoma virus的轉化蛋白質具有tyrosine phosphorylation的活性。這個發現暗示失控的tyrosine phosphorylation也許是腫瘤形成的關鍵。其後Harold Varmus以及Michael Bishop證明哺乳類細胞中具有與動物retroviral oncogene相似的成份──cSRC。他們兩人因此獲得1989年諾貝爾獎。這個發現進一步使科學家思考會經由tyrosine phosphorylation引起細胞內訊息傳遞的oncogene是否會導致人類癌症。

1980年代早期的實驗進一步支持tyrosine phosphorylation會產生訊息傳遞的概念。EGFRINSRinsulin receptor),PDGFRplatelet-derived growth factor receptor)均能被其個別的ligand活化,也就是所謂的protein tyrosine kinase。其後,Hunter等人發現EGF可以刺激A431細胞,PDGF能刺激NIH-3T3細胞導致growth factor receptor下游的成份迅速的tyrosine phosphorylation。但直到1980年代中末期,receptor tyrosine kinaseRTK)以及其下游夥伴的分子結構才慢慢露出端倪。

 

EGFR之結構剖析

由於molecular cloning技術的進步,在1970年代中期許多重要的荷爾蒙及生長因子的cDNADNA sequence以及amino acid sequence相繼揭曉,其中包括了insulinEGFIGF2NGFPDGFTGF-α。在1980年代cloning的技術更加進步,使科學家可以開始研究細胞表面receptor的分子結構。果不其然,1984 Imperial Cancer Research Fund(現併入Cancer Research UK),GenentechThe Weizmann Institute of Science的研究人員合力由正常胎盤細胞及A431腫瘤細胞分離出人類EGFR並決定其DNA序列。receptor tyrosine kinaseRTK)的基本構造終於被揭露。EGFR的多生肽序列公布之後,各方研究人員爭相進行與各種已知蛋白質的比對工作。ICRFMichael Waterfield拔得頭籌,率先發現人類EGFR的多胜肽序列與一種鳥類致癌基因(an avian oncogene)-v-erbB具有高度的相似性。v-erbB不久之前,才剛由Tadashi Yamamoto等人發現。EGFRv-erbB的高度相似性第一次將動物的致癌基因與一個控制人類細胞生長的細胞膜蛋白質畫上等號。研究人員陸續發現v-erbB oncogene的各種變化包括truncation, deletions, mutation,這也證明了這些v-erbB的突變是使一個protooncogene變成oncogene的原因。

(註:鳥類感染了avian erythroblastosis的病毒後,會發生惡性腫瘤。)

人類的EGFR是一個具有模組結構(modular structure)的glycoprotein圖一) 它分為:

1. an extra cellular ligand-binding domain

2. a transmembrane region

3. a cytoplasmic tyrosine kinase region

4. non-catalytic regulatory region

研究人員更發現了兩項重要的訊息:

1.人類A431 epithelial carcinoma cellsEGFR活性有25倍的增幅。

2.人類細胞中還有數百種與EGFR類似的基因序列,並進而發現EGFR family中其實有四個成員:1. EGFR, 2. human EGFR-related 2 (Her2 or neu/ERBB2), 3. the kinase-impaired HER3HER4

隨後,Genentech相繼發表了其他RTK的鹼基及胺基酸序列,包括INSRIGFI receptor (IGFIR)PDGFR,還有KITFMS兩個protooncogene。至此,我們終於知道各種RTK的生物學功能固然不同,但結構卻大同小異,也就是所有的RTK都具有與EGFR類似的domain。目前已知的RTK已達58個,分屬20family。其中一半已證實與人類癌症有關,因此就成了尋覓癌症治療最好的標的。

 

RTK的訊息傳遞

ligandEGFR結合時會引發兩個receptordimerization,進而引起EGFR cytoplasmic domaintyrosine residues發生autophosphorylation,而成為下游訊息傳遞者的根據地。

ligand引起EGFR dimerization之後,目前已知會引發一連串的訊息傳遞:RTK-GRB2-SOS-RAS-RAF- MEK-ERK以及P13K-AKTPLCrSTAT等幾個通路。在某些細胞內EGFR也可經由RAS-GTP活化P13K (圖二)

事實上,EGFR不僅與EGFR發生dimerization,也會和同類的receptor發生heterodimerization,例如EGFRINSREGFR的重要性在於它是諸多G-protein-coupled receptorsGPCRsmetalloprotease-mediated EGFR signal transactivation),cytokine receptors, integrins, membrane depolarization以及cellular stress訊息傳遞的匯集點,也因此EGFR影響了許多非常關鍵性的細胞行為,諸如proliferation, differentiation, motilitysurvival (圖三)

利用基因轉移小鼠,EGFR以及其他RTK在哺乳類發育的功能漸漸被揭曉。1995年學者報告Egfr knockout mice會發生embryo lethality或是許多器官(skin, lung, GI tract)上皮發育的嚴重缺損。這也證明EGFR和許多細胞行為和上皮發育有關。針對EGFR家族其他成員如HER2HER3HER4的基因剔除會造成神經及心臟發育的缺陷。研究也顯示其他Egfr的相關ligand,如EgfTgf-α,amphiregulin以及heparin-binding EgfHB-Egf)具有相當的重疊法(redundancy)。1998Roy Black等人報告一種metalloproteinasetumor-necrosis factor-α-converting enzyme, Tace)的剔除會導致與Egfr剔除小鼠同樣的變化,也就是多發性的上皮缺損。其後發現Tace其實是Tgf-α的ectodomain cleavagesolubilization所必需,也就是它會把ligand precursor變成ligand,因此也會影響Egfr的功能。

 

人類癌症中EGFR之變化

1980年代許多研究顯示各種人類上皮腫瘤均有EGFRover- expression,這也支持EGFR調控失誤在人類癌症扮演著重要的角色。接下來有三項發現更支持此一看法。

1. 藉由autocrine growth factor loops導致EGFR功能的增加是RTK調控失誤常見的模式,而其中以TGF-α引起者最為常見。

2. 人類癌症組織可以發現EGFR的突變,而其某些deletionpoint mutation確會導致EGFRcatalytic tyrosine-kinase的活性增強。最常見的突變是EGFRVIII,其exon 2-7缺損。

3. EGFRdown regulation失控,也是RTK deregulation的機轉之一。

 

HER2neu的發現

1985GenentechAxel Ullrich發現一種新的RTK其構造與EGFR高度相似,因此將之命名為human EGFR-related 2HER2)。另外的研究者也發現此一新的RTK,並以ERBB2名之。

有趣的是,HER2的染色體位置竟與大鼠的neu oncogene相同。這也顯示RTK與動物癌症發生可能相關。Robert Weinberg等人進一步報告,在NIH-3T3細胞中針對neu oncogene的單株抗體可以逆轉其transforming effect。至於HER-2與人類癌症的關連則需待臨床研究的驗證。UCLA的癌症醫生Slamon收集了許多原發性乳腺腫瘤。他利用得自Ullrich給的HER-2 gene probe來檢查這些乳腺腫瘤之DNA異常。1987年,SlamonUllrich報告30%的侵入性乳癌有HER2的過度表現,而HER2過度表現的病人存活較差且再發時間較短。此一結果確立了HER2過度表現是乳癌及卵巢癌形成的一個重要因子,而HER2也是這兩種癌症的預後指標。儘管如此,HER2ligand卻不知是誰。直到1998Sternkamps才發現EGFR的活化會經由heterodimerization引起HER2transphosphorylationNancy Hynes等人進一步發現HER2EGFRHER3以及HER4偏好的heterodimerization夥伴,而HER2也提供了另一條引發細胞內訊息傳遞的通路,同時也顯示EGFR這個訊息傳遞網路的廣泛影響力。

 

RTK為基礎的癌症治療單株抗體

在乳癌及卵巢癌中發現HER2基因的過度表現,提供了開發針對性癌症治療(target-specific cancer therapy)的大好機會。Genentech研究人員開始去發展針對HER2的單株抗體(HER2-specific mAbs)並在培養細胞及動物模式觀察它的制癌能力。這些實驗終於導致mAb4D5的人類化(humanization)並進一步成功地開發出第一個針對kinase的治療性抗體trastuzumabHerceptin, Genentech, Inc.)。1998TrastuzumabFDA核准用於HER2過度表現的轉移性乳癌。Trastuzumab會與腫瘤細胞表面的HER2結合,引起receptor的內化(internalization),抑制cell-cycle的進行以及免疫細胞的徵集。Trastuzumab在乳癌病人的療效,證明了在人類主要的癌症,針對oncoprotein治療可以奏效。

1989Hudziak等人報告另外一個針對HER2的抗體-2C4。此抗體之人類化形式稱為pertuzumabOmnitarg, rhuMAb-2C4, Genentech)。此藥目前進行phaseⅡ試驗,它可以干擾HER2-HER3 heterodimer產生致癌訊息。因此,對沒有HER2過度表現的乳癌此藥可能具有療效。1980年代,Mendelsohn等人針對EGFRextracellular epitopes設計了小鼠的mAbs 225528。由於在培養的人類腫瘤細胞株以及小鼠模式,此抗體顯示相當的抑癌活性,因此mAb 225被開發成臨床藥物。2003Swiss Agency for Therapeutic productsSwiss medic)核准了cetuximab臨床運用於化療無效的大腸直腸癌。這是一種Chimeric human-mouse anti-EGFR抗體。2004年初,美國FDA也核准cetuximab用於轉移性大腸直腸癌。cetuximab的開發過程長達20年,這段故事顯示一個新觀念的臨床應用所經過的漫長過程及重重險阻。

 

小分子RTK抑制劑

在證明EGFR以及tyrosine kinase是抗癌的標的之後,各藥物開發團隊莫不全力以赴,尋找特殊設計的小分子抗癌藥。1987Honegger等人發現EGFRATP binding pocket若發生突變,其tyrosine kinase的功能即會喪失。1994年學者報告了quinazolinetyrosine-kinase的抑制功能。二年後Wakeling等人報告gefitinibIressa (ZD 1839), AstraZeneca)是EGFR Tyrosine-kinase活性既強力又具高度選擇性的抑制劑。2002gefitinib在日本被核准用於不能手術的再發性非小細胞肺癌,隔年美國也予核准。

好幾個藥廠及研究室也陸續開發了其他的小分子tyrosine-kinase inhibitorCibaAlex等人開發了PKC inhibitor-Imatinib1996Druker等人報告imatinibBCR-ABL oncoprotein有強力的抑制作用。此一oncoprotein表現於帶有Philadelphia染色體之慢性骨髓性白血病細胞表面。它是一個constitutively active non-receptor tyrosine kinase。所謂Philadelphia染色體是第9號染色體與第22號染色體的reciprocal translocation。此一轉位導致ABL基因的第一個exonBCR基因的sequence取代。95%的慢性骨髓性白血病具有此一致癌性的轉位。更有趣的是,imatinib也可以有效抑制PDGFRKITRTK。由於KIT被認為在gastrointestinal stromal tumorGIST)扮演重要角色,因此imatinib也被成功地應用於GIST的治療。2001FDA核准imatinib用於CML2002年也被核准用於GIST

 

RTK及抗血管新生治療

VEGF及其receptor為治療標的

VEGF及其receptortumor angiogenesis具有重要的調控功能。1992De Vries發現FLT1FMS-like tyrosine kinase)是VEGFreceptor。其後另一個VEGFreceptor-FLK1 or KDR也被發現。這兩個RTKangiogenesis的功能在基因剔除鼠相繼被釐清。1990年代兩個經典研究證明了VEGFVEGFR訊息傳遞系統在tumor angiogenesis的重要性。Napoleone Ferrara等報告小鼠的anti-Vegf抗體會消除裸鼠身上的移殖腫瘤。Birgit Millauer等則指出dominant-negative Vefgr2 mutant會阻斷裸鼠皮下glioblastoma腫瘤的生長,此一療效在其他不同的腫瘤也陸續被報告,這兩個實驗很清楚地告訴世人針對相關的ligandreceptor可以達到anti-angiogenesis的目的。

以這些實驗為基礎,研究人員開發針對VEGFmonoclonal neutralizing  antibodies以及針對VEGFR的小分子化學藥物。BevacizumabAvastin, Genentech)是針對VEGF的人類化抗體,近年已被FDA核准用於大腸直腸癌的治療。BevacizumabFDA核准的第一個抑制angiogenesis藥物。針對VEGFR的第一個小分子藥物是SU5416SugenPfizer),隨之還有SU6668。這些化合物可以競爭性地阻斷ATPreceptor tyrosine-kinase domain結合,藉此在生物體上抑制tumor angiogenesis以及數種人類腫瘤xenograft的生長。相關化合物還有SU11248可以針對好幾個RTK,包括KITPDGFRFLT3以及VEGFR2,目前已用於多種癌症的phaseⅡ試驗,此外其他的血管新生抑制藥物如ZD6474AstraZeneca)和PTK-787NorvatisSchering)也相繼進入phaseⅡ或phaseⅢ臨床試驗。

20年來,由第一個RTK,也就是EGFR的選殖開始,我們對於RTK的生物學知識和它們失控的後果已有初步的瞭解,也衍生出Trastuzumab, imatinib, gefitinib, cetuximabbevacizumab等有效的分子藥物。臨床上,好幾個針對RTK的治療策略已在進行,例如,在急性骨髓性白血病使用FLT3的臨床評估,或是針對IGF1RMETVEGFR3TIE2TRKreceptor的臨床前研發。不過此類藥最適當的使用劑量及方法,以及在CMLGIST病人中已經發生的抗藥性問題都有待進一步釐清。

近來high-throughput sequencing技術,加上生物資訊學,被用來有系統地分析大腸直腸癌的tyrosine kinase。這種大規模的搜尋已經找出好幾個新的tyrosine kinase基因的突變。這些變異可能成為新的治療標的。由於癌細胞訊息傳遞網路高度複雜的變化,以genomics為基礎的技術如gene-arraytissue array以及SNP分析將有助於確認對某特定藥物有療效的病患,而使此類藥物的使用更為精確而有效。不過由於癌細胞基因體的強大可塑性,我們必需發展出結合小分子藥物及抗體的混合治療,善用他們各別和互補的效力,以達成對癌症最有效的治療。

 

Gefitinib對那些Non-small cell lung cancerNSCLC)有效?

Gefitinib之用於NSCLC是源於EGFR在肺癌組織的表現遠高於臨床的正常組織,但患者肺癌組織的EGFR表現程度(以immunohistochemistry檢查)並不能預測該患者對gefitinib之反應良否。初期的臨床試驗顯示日本的NSCLC患者對gefitinib之反應率為27.5%而美國的患者(歐洲裔)只有10.4%。在美國的患者中對gefitinib反應較好的常為女性,非吸煙者,腺癌。

因此,研究人員開始檢視病人肺癌組織內EGFR的突變,試圖以之來解釋對gefitinib的反應的不同。

20044Paez等人以及Lynch等人同時在ScienceNew England Journal of Medicine發表他們各別的研究結果。Paez等人發現58個來自日本的NSCLC檢體中,15個帶有EGFRsomatic mutation,而61個來自美國的檢體,只有1個被發現有EGFRsomatic mutation。作者再檢視5個對gefitinib反應良好患者的手術前檢體與4個療程中繼續惡化者的檢體,結果前者5人均有EGFR的突變,而後者4人則沒人有EGFR突變(P0.0027)。在gefitinib反應良好者與一般未經選擇的患者,EGFR突變的比率也有顯著差別(5/5 vs 1/61P10-12)。

Lynch等人則發現9個對gefitinib反應良好的NSNLC患者,8個的肺癌組織帶有EGFR突變,7個反應不佳的病人,均無EGFR突變(8/9 vs 0/7P0.001)。綜合這兩個研究,我們可以說,NSCLC病患對gefitinib的反應良否取決於其肺癌組織的EGFR有無突變。

EGFR分成三個domainintracellular domainL1-CH1-L2-CH2),transmembrane domainkinase domain,再加上regulatory element。有些腫瘤,例如glioblastomaEGFR mutation可以發生在extracellular domain,產生了很長的deletionmissense mutation,也可以發生在細胞內的regulatory element。具有這兩類EGFR突變的腫瘤對gefitinib均無反應,只有在kinase domain發生突變的腫瘤,gefitinib才有療效。

EGFR kinase domain的突變,計有三種(圖四)

1.位於P-loopG719S突變(substitution

2.位於Activation loopL858R突變(Substitution

3.位於codon 746 to 759multiple deletion mutation

這些EGFR kinase domain的突變均發生於kinase的要害,因為Activation loopp-loopprotein kinase進行autophosphorylation的重要結構。上述EGFR kinase domain的三種突變均是somatic origin,其中前兩者為heterozygous,而後者為homozygous

Sordella等人進一步發現,NSCLCEGFR突變種會選擇性地活化AKTSTAT訊息傳遞通路,而促進細胞的存活(survival)。此突變種對ErkMAPK通路則無作用,因此對細胞增殖(proliferation)並無影響。

利用Si-RNAEGFR突變種knockdown或使用AktSTAT訊息通路的阻斷藥物,均可促進表現mutant EGFRNSCLC細胞株發生大規模的apoptosis。因此,mutant EGFR會選擇性地傳遞NSCLC細胞所需的survival signal,也就是NSCLC細胞必需依存於mutant EGFR所產生的survival signalgefitinib則會抑制此EGFR mutant所產生的survival signal,這也是Gefitinib之所以具有療效的關鍵所在。

既然NSCLCgefitinib的療效是取決於EGFR kinase domain有無突變,下一步當然是在開始治療前,先行檢查病患NSCLC腫瘤有無EGFR Kinase domain的突變,今年八月兩家美國公司就推出了此項檢查,索費5002000美元。

至此,gefitinib加上腫瘤EGFR mutation的檢測終於使大家期待已久的分子治癌神藥成為事實。接下來就是如何再去尋找這樣的組合來治療其他的common cancers。不過gefitinib會不會像治療CMLGleevec一樣,產生drug resistance,就有待進一步的觀察。

 

 

取材文獻

1. Paez et alEGFR Mutations in lung cancerCorrelation with clinical response to gefitinib therapy. Science 304:1497-1500, 4 Jun, 2004.

2. Lynch et alActivating mutations in EGFR underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib N. Engl J Med 350 (21): 2129-39, 20. May, 2004.

3. Gschwind et alThe discovery of receptor tyrosine kinase inhibitor targets for cancer therapy. Nature Review Cancer 4:361-369, May, 2004.

4. Sordella et alGefitinib-Sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways Science E-pub 29 July 2004.