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閒話基因體科學_20.巴黎SCID基因治療意外事件簿
by 陳怡蓁, 2012-08-21 13:47, Views(955)

巴黎SCID基因治療意外事件簿

 

臺大醫學院  謝豐舟教授

 

兩年前,法國巴黎Necker醫院Hacein-Beg-AbinaFischer所領導的團隊成功對10名患有SCID-XIX-linked severe combined immuno-deficiency亦稱Interleukin-2 receptor common γ chain deficiency 的病童藉由反轉錄病毒為媒介(vector,將γc chain 基因轉殖到病童自身的CD34骨髓細胞,再回輸給病童。經過這種基因治療10名病童有9名成功地獲得正常的免疫力得以過正常生活。美國賓州大學曾有一名17歲青年因接受以腺病毒為媒介的基因治療而引發全身性腺病毒感染終而不治。此一意外事件使大眾對基因治療投以懷疑的眼光。法國巴黎團隊成功地以基因治療矯正SCID-XI病童的免疫缺陷使大家又對基因治療重燃希望(圖一)

事與願違的是9名病童中有二名竟然在治療後3034個月先後出現白血病症狀T淋巴球高達300,000/mm3必須接受白血病之化學療法及骨髓移植。此一事件使基因治療的安全性又亮起紅燈。本文將介紹此二位白血病病童之臨床過程及各項檢查結果。一方面探討以反轉錄病毒為媒介的基因治療與白血病之關聯並藉由此例探索白血病之成因。

兩位病童接受基因治療時分別為一個月(P4)及三個月大(P5)。醫生使用long terminal repeat (LTR)-driven MFG vector 將γc gene 轉殖至病童本身之CD34+骨髓細胞再將之回輸給病童。二位病童分別接受18x10-620x10-6 CD34+γc+ cell/Kg在九位接受治療的病童是屬於較高的劑量(range 1.1x10-6~22x10-6median 4.3x10-6)。可喜的是二個月後病童的CD3+T細胞均快速上升四個月時已達4,000-5,000/ul較諸其他病童P4P5T細胞上升的速度顯得比較快速。在接受基因治療之後二位病童T細胞的特徵與相同年齡的對照組並無差別但到了30個月(M+30)34個月(M+34)時開始出現異狀。P4M+30γδT細胞開始增加其後三個月T細胞在50,000~80,000/μl之間徘徊但並無臨床症狀。到M+34T細胞數目急速上升至300,000/mm3血液中並出現blast。骨髓有浸潤現象且脾臟腫大。病童旋即接受T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) 的傳統治療。在M+40時並接受配對的非親屬骨髓移植其時尚有minimal residual diseaseP5M+34也出現T細胞增殖的現象合併貧血縱膈腔擴大及脾腫大。P5也接受T-ALL之化學療法在二個月後達到緩解。雖然P4M+45時尚有少量不正常細胞但病人隨後情況良好。

 

T細胞特性

P4之週邊血液出現表現monoclonal T cell receptor γδ之T cell clone (Vγ 9V δ1) 。這些細胞的表現型相當成熟也沒有其他血液細胞的抗原。細胞表面可以偵測到與成熟T細胞相當的γc表現量。染色體檢查則呈現partial trisomy 6 with t6:13translocation。至於P5的周邊血液則出現三株不同的TCR αβ T cell clonesvβ1 ,vβ2vβ23)。這些T細胞有成熟的表現型而細胞表面也有γc之表現。染色體檢查則顯示trisomy 10 及特殊的SIL-TAL1 fusion transcript。這二個病例均有成熟T細胞失控的繁殖並呈現出白血病的臨床表現。

 

反轉錄病毒之複製

P4P5之血清(M+3  M+34) 均無反轉錄病毒複製的現象。Southern hybridization 也偵測不到amphotropic envelopereverse trans-criptase 以及 integrase 等基因。最近被報告與轉移性黑色素瘤有關的murine leukemia virus particle VL30 murine retrotransposon 亦無存在的跡象。

 

LMO 2 基因作之插入性突變( insertional mutagenesis)

在發病前病童之T細胞顯示反轉錄病毒插入的位置在50處以上每一個細胞只有一個插入。但T細胞開始增生時P4P5 均各只有單一插入位置。P4反轉錄病毒的單一插入

位置可以定位到11號染色體的短臂接近LMO 2基因座的遠端啟動子也就是在第一個intron 內反方向插入(位置為45,229而第一個exon 則始於44,218)。P5之單一插入位置亦在LMO 2 基因座位置在41,253LMO 2第一個exon 上游3 kb(圖二)LMO 2LIM domain only-2 基因是富含cytokine LIN-11 Isl-1 Mec-3LIMfinger protein。此轉錄因子扮演著血液生成中心調控者的角色。

        圖二 病童P4P5LMO2基因序列上provirus 插入的位置

 

Northern blot analysis 顯示病童的T細胞具有與預期大小相符的3.3kb LMO 2 transcript而對照組的TCR γδ+ 與αβ+ 細胞則無。定量PCR 顯示病童T 細胞LMO2之表現量與mouse erythrocystic leukemia (MEL) 細胞株相當。從兩位病童的T細胞都可以偵測到相當量的LMO 2蛋白質相當於MEL 細胞株與transfected Chinese hamster ovary LMO 2 蛋白質表現量。使用針對LMO 2及γc RNA FISH 檢查顯示兩者位置重疊(co-localization表示兩個個案中轉錄 LMO 2的就是反轉錄病毒插入的LMO 2 allele。藉由分析P4LMO 2 allele exon 1的一個SNP證實了兩個個案都是retroviral cis activation 導致LMO 2 單一allele 的表現。推測應是 retroviral LTR (long terminal repeat)LMO 2distal (hemato-poietic) promotor 發揮了enhancer的作用不過也有可能retrovirus integration 干擾了原來存在的silencer 導致LMO 2 基因轉錄的啟動。在T-ALL細包胞我們已觀察到染色體轉位 t11;14)(p13;p11)及t7:11)(q35;p13)均會觸發LMO 2不正常的表現lmo 2 轉殖鼠(lmo 2 過度表現)在10個月內都會出現T-ALL。總結來說在這兩個白血病個案LMO 2 的不正常表現是增生T細胞的標記而這些LMO 2 蛋白質可能是促發cellular transformation 的元兇。

 

Clonal expansion 之過程

回溯分析顯示P4M+13 時已出現LMO 2 陽性的Vγ9Vδ1T cell clone然後呈現指數型的快速連續增殖M+34時終於發生臨床症狀。P5則在發病前三個月就已出現不正常的T cell clone。這兩位病童的表現型與LMO 2轉殖鼠極為類似強烈支持以下說法:白血病的出現需要附加的因素來引發我們所觀察到的次發性基因體改變(Additional factors leading to secondary genomic altereation were required for the development of leukemia-like stage of lymphoproliferation)

此外還有以下數個因素可能與白血病的發生有關:

1. 不正常的common γC chain 可能有利於transduced cell 的增生。不過實驗顯示這兩位病童並無γc chain之過度表現我們已知γc chain發生gain of function mutation時會經由激發JAK3 tyrosine kinase 而導致細胞增生但研究人員檢查JAK3phosphorylation狀態也沒有發現JAK3發生constitutive activation的證據因此這二例白血病的發生應該不是γc chain所單獨誘發。不過γc chaintransgene 也可能與過度表現的LMO2 合力促成不正常細胞增生。

2. Varicella Zoster virus 之感染。P4M+30曾發生varicella zoster virus的感染P4T cell genome 也可以找到該virus genomeVZV 感染可以導致免疫抑制狀態有利於不正常細胞的增生VZV引起的對病毒的免疫反應也可能觸發不正常T細胞的增生。不過由於P 5並無VZV感染因此VZV的角色存疑。

3. 遺傳傾向:P4的姐姐及一位表親都發生childhood medullo-blastoma也許P4就有發生腫瘤的家族傾向但檢查P4TP53ATMMLH1 MSH2 均無突變現象也沒有loss of heterozygosity的證據。P5則沒有相關家族史所以遺傳傾向的角色可能不大不過最近研究發現新生兒的臍血細胞帶有顯著的leukemia associated rearrange-ment。假設P4P5有此現象retrovirus insertion 可能會刺激這些不正常細胞的增生。

總結而言這二例反轉錄病毒基因治療SCID-X所併發的白血病其可能相關成因為

1.        LMO 2基因之活化。

這可能因該基因上有反轉錄病毒插入之好發點(physical hotspots也有可能是反轉錄病毒插入該處之後使這些細胞有天擇的優勢而引發其後續增生。據估計反轉錄病毒插入一個活動基因的機率為1x10-5。每個病童約接受1x10-6 transduced T cells, 也就是每人會有1-10LMO 2- targeted T cell

2.        SCID-XI之狀態

SCOD-XI之疾病狀態可能也有助於白血病之發生。由於SCID-XI之病人有T細胞分化障礙(differentiation block)導致CD34細胞中有較多的T細胞前身, 使得反轉錄病毒插入的機會增加。

3.        Empty compartment的存在有利於T細胞的繁衍。

4.        年齡

P4P5,是十位病童中年齡最幼者, 也許新生兒的較強造血功能也有助於白血病的發生。

白血病通常伴隨有染色體的異常如最著名的Philadelphia chromosome9號與22號染色體的轉位。本文中的二例亦均有染色體異常P4t6:13)所致的partial trisomy 6P4則有trisomy10 SIL-TAL1轉錄稿。到底是反轉錄病毒插入引發LMO2的過度表現在先還是染色體的變化在先作者並未交代。一般白血病染色體之異常到底是因是果也未可知。除了染色體的變化也必然還有其他因素而本文之兩例明顯有一外來因素就是反轉錄病毒插入引發LMO2的過度表現但此一因素在發病上到底扮演多重的份量是仍待釐清的謎團。

Rabbitts等人指出LMO2相關的染色體異常是因RAG recombinase 的錯誤所致。Rag I基因係表現於T細胞分化過程中的DN2/DN3細胞上面而LMO2表現的會導致DN3T細胞的累積。總合來說DN2/DN3細胞上RAG中介的錯誤導致染色體轉位的發生LMO 2 的加強表現更導致T細胞發育的抑制及白血病的誘發。

過去癌症的發生被認為是源於某些基因的突變但近來有些學者認為根本的問題是染色體的不平衡(aneuploidy)。染色體的aneuploidy會導致幾十幾百個基因copy number及活性的異常在目前尚不清楚的機轉下終會波及oncogene tumor suppressor gene 而導致癌症的發生。因此癌症生成的焦點似乎又回到染色體身上。一般實體腫瘤由於存在的時間相當長久因此染色體的變化極不規律而又複雜相形之下血液腫瘤因為形成的時間不久其染色體變化較為單純而有跡可循。

對於同卵雙胞胎均發生白血病以及白血病病童新生兒血片的檢查證實融合基因(MLL in ALL, TEL-AML1 AML1-ETO in ALL AML)在出生前即已存在。這顯示染色體轉位功能性融合基因及白血病前期細胞應該在胎兒血液生成(fetal hematopoiesis)的過程中發生於幹細胞而在出生時即可在周邊血液中偵測出來。這些不正常的細胞作為引子(initiating events) 加上後來發生的一個或多個遺傳事故(genetic event )才演變成臨床上的白血病。因此學者預測新生兒血中融合基因存在的機率應該遠大於該型白血病的發生率。Mori等人在新生兒臍血中果然發現白血病常見的融合基因TEL-AML1 AML1-ETO的存在機率為同型白血病發生機率的10倍。他們也進一步證實這些染色體轉位的發生侷限於白血病源起的B lymphoid myeloid lineage。帶有融合基因的細胞可高達10-4~10-3也顯示這是一個progenitor族群相當程度的繁衍

因此法國這二例基因治療後併發白血症的病童,其造血幹細胞可能本來就有不正常的染色體轉位存在當成引子而反轉錄病毒插入引發LMO2的過度表現則是引爆白血病的額外遺傳事件。不過令人困惑的是T細胞急性白血病向來有許多不同的染色體轉位基因何以這二例都插入LMO2基因?

Frank 等人認為癌症的發生可能源於個體生長時期幹細胞發生的突變。個體成長時幹細胞是呈指數型的快速增殖(exponantial growth個體成長後幹細胞仍然持續增殖但其速率則保持水平。Frank認為只有在幹細胞呈指數型生長時發生的突變才足以造成日後癌症的發生他們並以一個簡單的數學模式加以闡明。

這起基因治療後併發的白血症事件提供了我們對基因及染色體的運作一個有趣的觀察機會。就像有人說“ Mother Nature only reveals herself when something goes wrong自然運作的奧秘確實只在意外之中掀起她神祕的面紗。

社會大眾在生物醫學界的誘導下對基因治療充滿了好奇與期待以為它將是解決人類疾病的一個仙丹妙藥。事實上一個外來的基因要在細胞內發揮它特定的功能有兩個先決條件:

1.   要到達該到的位置。

2.   要能適當地正確地調控其表現。

從本文兩例來看今天的科技顯然無法控制治療基因到達的目標地點因此這些治療基因進入細胞後就像沖天炮而非導向飛彈,遑論能正確地登陸火星。至於調控其表現更是高難度。這可以從科學家對火星探測車的控制可見一斑。要探測車轉個方向、訊號要經過一億多公里而太空車本身也不見得聽話。當您瞭解基因的調控,有太多的epigenetic factors,如chromosome remodellinghistone methylation or acetylation,左鄰右舍都會影響其表現,甚至連1Mb之外基因沙漠中的enhancer也有影響,您就知道其實我們對治療基因的調控是只有keep your fingers crossed(聽天由命)。具体的說,今天的基因治療其實只是blind gene transfer,也就是放沖天炮。因此科學家體認到要實施有效的基因治療之前還有許多基本功課要做。而accurate and safe targeting就是第一步要解決的問題也奉勸研究同仁在奢言基因治療之前gene transferregulation先多花點心思。

註:在巴黎接受基因治療的SCID病童中,近來又出現第三例白血病

 

 

推薦讀物

1. Hacein-Bey-Abina S et al:LMO2-associated clonal T cell proliferation  in two patients after gene therapy for SCID- XI. Science 302:415, 2003 .

2. McCormack MP et al: The LMO T -cell oncogene is activated via chromosomal translocation or retroviral insertion during gene therapy but has no  mandatory role in normal T-cell development. Molecular  and Cellular Biology 23:9003, 2003.

3. Yamada et al: The  T cell leukemia  LIM protein Lmo2  is necessary for adult mouse  hematopoiesis. Pro Natl Acad Sci USA 95: 3890, 1998.

4. Mori H et al: Chromosomal translocations and covert leukemic clones are generated during normal fetal development. Pro Natl Acad Sci USA  99:8242, 2003.

5. Malik AK et al: Effects of a second intron on recombinant MFG retroviral vector. Arch Virol 146:601, 2001 .

6. Valge-Archer VE et al: The LIM protein RBTN 2 and the basic helix-loop-helix protein TAL-1 are present in a complex in erythroid cells. Pro Natl Acad Sci USA 91:8617, 1994.

7. Frank SA et al: Developmental predisposition to cancer. Science 422:494, 2003.