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閒話基因體科學_12.從玉米探索基因體的奧祕-Barbara McClintock(跳躍基因的發現者)
by 陳怡蓁, 2012-08-21 13:36, Views(1356)

從玉米探索基因體的奧秘

—Barbara McClintock(跳躍基因的發現者)

 

臺大醫學院 謝豐舟教授

 

1983年諾貝爾生理及醫學獎頒給高齡81Barbara McClintocK女士(圖一)。在她發現基因體的轉位(transposition)之後32年,終於受到世人肯定。同一年,她所描述的「解離子」及「啟動子」(dissociator& activator)轉位因子也被真正分離出來,使她的學說更為具體化。在人類基因體定序完成的今日,我們知道人類基因體上有高達45%是所謂的轉位單元(transposable elements),而這些轉位單元在生物基因體的形塑與進化上扮演相當重要的角色。McClintocK早在DNA的雙螺旋結構被揭曉前,就憑著對玉米仁顏色無比密的觀察提出基因轉位的觀念。雖然當時的學界幾乎無人理會,但時間終於證明這位「玉米田裡的先知」確實在全無分子生物學技術的協助之下,獨力揭開了基因體一項極其重要的秘密。

1902McClintocK出生於一個醫生的家庭。1919年她不顧父母的反對,進入康乃爾大學的農學院,時年17歲。她的大學生活充滿了樂趣(圖二),但是到大三快結束的時候,她就朝著專業科學家邁進。大三時她接觸到一門對她特別有興趣的課-遺傳學,修完之後教授鼓勵她更進一步去修讀研究所開的遺傳學,但是由於開設遺傳學的植物育種系不收女研究生,因此她只得到植物系的研究所註冊,主修細胞學(研究染色體)副修遺傳學及動物學。進入研究所之後,她在植物系細胞學教授沙普(Lester Sharp)的指導下,學會了細胞學的實驗技巧(其實是觀察染色體的方法學),也很快地可以獨立完成實驗。沙普教授認定她具有「研究頭腦」而全力支持她的研究工作,給她絕對的自由。(圖三)

    在唸研究所的第一年,她發明了一種玉米染色體的辨識方法,能夠分辨出玉米細胞的各個染色體。當時有人剛發展出一項新技術,大大地簡化了以顯微鏡觀察染色體的玻片準備手續,McClintock更將之作了種種的改進,使它的方法更適合玉米的研究工作。經過染色的玉米細胞在分裂及複製的周期中,各個染色體的動向很容易觀察。運用這些新技巧,她把玉米十條染色體依長度予以編號(最長的1號〜最短的10號),同時她也辨認出各條染色體特殊的型態-包括長度、形狀與構造。更重要的是不同品系玉米其染色體形態差異很大,顯示有些染色體特徵可以用來標識不同玉米品系的遺傳特徵,例如某個品系的第九號染色體尾端,具有一個明顯而深色的結,辨認這些染色體上細微特徵的本事,成為她日後探索遺傳學領域的有力工具。而McClintock真的藉此在接下的幾年內,利用玉米進行其他生物都做不到的精密細胞遺傳學(cytogenetics)分析,陸續發表了許多開創性的論文,確立了她在細胞遺傳學界的重要地位。

1927年,McClintock完成研究所學業,獲得植物學博士學位,並被聘為講師。接下來她的挑戰就是利用玉米研究當時已經在果蠅中發現的連鎖群(linkage group),也就是探究生物性狀的遺傳與染色體位置的關聯,亦即某個遺傳特徵是在哪一個染色體上?而老天幫忙,一位具備果蠅實驗經驗的遺傳學碩士-羅茲竟然想到康乃爾研究玉米,修讀遺傳學博士學位,他與McClintock一拍即合,加上另一位來自內布拉斯加州玉米田的研究生-畢多(George Beadle 19031989)形成了玉米細胞遺傳學的黃金組合,開闢了全新的領域。首先,她利用第九號染色體上帶有深色小結的玉米品系,證明了遺傳交換與染色體交換之間的關聯。1931年春季,遺傳學大師摩根(Thomas Morgan)到康乃爾訪問,得知McClintock對於遺傳交換與染色體交換的研究,當場就要來紙筆,寫了一封信給美國國家科學院期刊(PNAS)的主編,告訴他們兩周後會收到一篇論文,結果那篇論文於七月七日寄到,而於19318月刊出。要不是摩根的果斷推薦,這份榮譽可能被以果蠅進行相同研究的史特恩(Curt Stein19021981)捷足先登。

儘管McClintock研究成果非常耀眼,但在30年代,女性還是不能在大學謀得正式的教職。因此1931年她就離開康乃爾,在美國國家研究委員會的贊助下在密蘇里大學,加州理工學院及康乃爾三地往返奔波從事研究(圖五)

1927年馬勒發現X光誘導突變的效應。密蘇里大學的史塔德勒將它應用於玉米的遺傳研究,帶動了McClintock的興趣。由於X光大幅提高突變發生的機率與種類,加速了遺傳研究的進展,McClintock就以她豐富的染色體辨識技巧研究X光對玉米染色體的影響。結果她發現在減數分裂的過程中,正常的染色體與X光照射過的染色體進行交換之後會發生轉位(translocation)、倒置(inversion)及缺失(deletion)等種種的變化。這些精采的染色體變化使她興奮不已。

    有一天,她在玉米田裡發現一些葉片帶有斑彩(mosaicism(圖六)的玉米株,不久她看到一篇論文提到某條染色體的迷失,可能是斑彩的原因。她很直覺地就認為染色體的迷失與環狀染色體(ring chromosome)有關,於是她就請史塔德勒在密蘇里代為栽植可以產生彩斑的玉米品系。幾個月後玉米成熟,她親臨密蘇里加以檢驗,果不其然,這些玉米株的染色體居然真的有ring)。這種神乎其技的推理顯示她常年累積的對玉米性狀與染色體變化的觀察已經使她進入一種直覺的狀態,也就是看到一個玉米性狀的變化,腦裡面立刻浮現相對應的染色體變化。

長久以來,她注意到第六號染色體尾端的一個小東西,它緊貼在六號染色體與核仁(nucleolus)連接的地方。當時學者對核仁的性質與功能仍一無所知。McClintock注意到這小東西總在核仁附近,推斷它與核仁必定有所關聯。後來在加州理工學院她注意到這個小東西分裂成兩半,一半留在原來位置,另一半卻和不同染色體連在一起。於是她再請人栽植同品系的玉米,隔年冬天再回來檢驗。在顯微鏡下,McClintock發現原來這個小東西會把原來就存在那裡的物質組織起來,變成核仁。因此她就稱之為核仁組成中心(Nucleolus Organizer RegionNOR),同時她推論,必須有NOR才能生成正常核仁(圖七)。這個推斷至今仍然成立。目前我們已知NOR其實是許多rRNA gene的集合體,但NOR如何組成核仁至今仍不甚清楚。

在分子生物學尚未萌芽的1930年代,McClintock就能對細胞核、染色體、核仁有這麼透徹的觀察實在令人驚奇。她自己說:「我每次在觀察一個細胞的時候,都會跑進那個細胞裡四處看看」。「四處看看」的結果,就是她把最基本的生物過程(biological process)描繪出來。19311933的這兩年半,對她而言,真是一段獨立自由而多產的好時光。她說「我每天早晨都巴不得快點起床,立刻開始工作,就像個小孩子早上等不及起床,想趕快去做自己愛做的事」。

雖然McClintock表現傑出但卻仍然找不到固定的職務,1936年她終於在密蘇里大學獲得助理教授的職位。雖然她聲譽日隆,在1939年成為美國遺傳學會副會長,但她在大學裡卻過得不甚愉快,終於在1941年離開密蘇里大學,這可能與她勇於冒險、心不在焉,或者藐視權威的特質有關,尤其她那心直口快的特性更可能惹人嫌。她自己對學院生活感到心灰意冷,她說像我這樣特立獨行的人,絕不可能在大學裡生存,幸而研究工作已經有了它自己的生命力,像一個生命體,能對她在情感及智能上所投下的心血加以回報,給她安慰與滿足,補償了種種不如意。就如愛因斯坦所說的在狹隘,飄忽的私人經驗裡,永遠不可能找到的安祥與寧靜

 1942年她開始任職於卡內基協會設於冷泉港(Cold Spring Harbor)的遺傳所,在那裡她有一份薪水,一塊玉米田,一個實驗室,還有一個家。遠離大學的紛紛擾擾,不用參與教學和行政。從此她可以在這個田園式的遁世環境進行自己的研究(圖八)1944年,McClintock獲選為美國國家科學院院士,她是有史以來第三位獲得此項殊榮的女性。繼被選為國家科學院院士之後,1944年底McClintock當選美國遺傳學會會長有史以來第一位女性會長。1940年代是分子生物學開始萌芽的時機,1944年愛弗里等人發現DNA是傳遞遺傳性狀的物質,這劃時代的發現當時也沒有引起太多的注意。其時,McClintock回到冷泉港實驗室,開始進行最後導致她發現「轉位」現象的一連串實驗。

為了延續過去對玉米斷裂-融合-形成橋的研究,她利用一種第九號染色體斷裂的玉米株進行自體受精,結果在同一株幼株上,可以看到不同的條紋或斑點,也就是有所謂斑彩mosaicism(圖九)。這些斑點反映的是遺傳的不穩定性,有人也稱之為可突變基因(mutable gene)。單位面積內斑點數目的多寡,可以作為幼株在該發育階段內發生突變頻率的指標,因為每一塊顏色代表從單一突變細胞繁殖出來的細胞群,突變發生得早,形成的細胞多,斑點也愈大,突變發生得晚,形成的斑點就小。每一株幼株都呈現特定的突變率,在它的生命週期內都不會改變,這意味有某種因素在決定個別幼株突變的頻率。McClintock進而注意到,有些斑點組織卻呈現與整個植株不同的突變率,亦即有些細胞群呈現出獨特的突變率,也就是其源起細胞具有與母株不同的突變率。這種現象也會成對出現。她自己的描述是「兩個毗鄰的區域在突變率上顯示相對的關係。一個區域的突變率大大增加,而其姊妹區的突變率大大減少,而這兩個相連區域是從同一生長點上的一對姊妹細胞所衍生出來。」她認為兩個姊妹細胞發育的分歧,可能與生物體組織分化的機轉有關。從這個起點開始,McClintock其實開始進入「發育遺傳學」的新天地。在其後兩年,她積極為這個現象尋求解釋,兩年的光陰終於讓她得到答案,原來這個突變率的分歧是一種染色體上受到控制的斷裂(亦稱解離dissociation)所致,也就是基因旁有一種成分,它會對另外一種因子所發出的訊號產生反應,造成自身的解離。她將這個系統定名為Ds-Ac系統,Ds代表解離子,As代表啟動子,這是她在轉位研究的處女作。(圖十)

藉著反覆的育種實驗及染色體分析,她定位出解離染色體斷裂的位置-第九號染色體的短臂,離中心粒三分之二處,她將之命名為Ds基因座。接著她又發現Ds基因座只有在另一個顯性因子存在時,才會進行解離,她將該因子命名為Ac,因為它會啟動Ds,而Ac基因座位於第九號染色體的長臂,與Ds基因座相去甚遠。Ac基因座本身並無直接的表現型,必須透過它對Ds的作用才能辨識。它的表現就如一個單獨、獨立、顯性的基因座,更重要的是它的效應並非一般的「有或無」,而呈現劑量多寡的效應。利用玉米胚乳中的三套染色體(3n),她發現Ac劑量愈高,Ds突變發生的時間就愈晚(斑點愈小),她進而假設(1Ac基因座是由幾個相同的單位,直線排列組合而成,(2)這些單位的數目會在染色體複製時,使一個染色體增加單位,而其姊妹染色體失去單位。根據這些觀察,她論述如下:「如果有兩個斷裂點分別發生在Ds基因座的兩端,則帶有Ds的染色體片段被釋放後,可以插入或接上任何一個也同時發生斷裂的染色體片段,透過這樣的機制,Ds便可以變換位置。Ac藉由引發Ds基因座在原位上發生斷裂而控制這類事件的發生」。McClintock1948年公開發表這個「轉位」的名詞與觀念。1950年她在PNAS發表「玉米可突變基因座之起源及行為」,簡短地闡述了AcDs轉位的現象(圖十一),她也提醒此一現象與果蠅實驗中發現的不穩定遺傳現象(包括著名的位置效應position effect)相似。1951年夏天她首次在冷泉港研討會上發表「轉位」的演講,但現場反應一片死寂,似乎觀眾中沒人了解她在說什麼,接著會場中一片竊竊私語,還夾雜著偷笑聲。對著這個極端負面的反應,McClintock非常失望。六年來的心血,大家竞不屑一顧。1953年她在遺傳學發表的論文,只有兩個人來要抽印本,1956年她再次演說,反應更為冷淡。對一向在學術研究上備受推崇的她,簡直是天大的打擊,自己好像處在孤立狀態,甚至有人說她只是個在冷泉港混了好多年的老女人(圖十二)

為什麼她的轉位理論無法引起共鳴呢?其原因不外:

1. 當時分子生物學才剛萌芽,1953Watson and Crick才發表DNA雙螺旋結構,遺傳才開始獲得物理基礎(physical basisMcClintock就提出這麼複雜的觀念,幾乎走在時代之前30年,難怪就如「雞同鴨講」。

2. 當時的主流思想認為基因是固定的、不變的遺傳單位(particulate gene),McClintock居然說基因可以被調節、改變,簡直是「大逆不道」。

3. 玉米的育種實驗系統,在當時講求追求單純的研究理念下,既反潮流又複雜難懂,可以說有耐心,聽得懂玉米實驗資料的人「寥寥無幾」。

4. McClintock的實驗對象是玉米五花八門的性狀變化,以及顯微鏡下染色體形態及位置的仔細觀察,可以說是一種visual evidence相對物理學、化學的客觀實驗數據,大家覺得McClintock的實驗結果既難瞭解又欠客觀,當然對她的理論「敬而遠之」甚至「冷嘲熱諷」。

5. McClintock對玉米的研究已經臻於「天人合一」的境界,憑著長年累積的心得,她幾乎已經進入玉米細胞內,親身觀察玉米的染色體形態及活動。這種「心靈視野」往往是一般人不能理解的,類似的境界在發現原子的皮蘭(Jean Perrin)也可以看見原子,密立根(Robert Millikan)也看見了電子,愛因斯坦曾說數學本身是可以看見的。McClintock的研究是比較視覺的(visual),類似藝術作品,欣賞者若無共通的語言、共通的視野是難以體會其「精妙之處」。

然而,真理終究不會長久埋沒。60年代,學者致力於研究大腸桿菌操作元(operon)。他們發現了具有特殊插入序列(insertion sequence)的DNA片段會插入別的基因之中,而這些具有插入序列的DNA片段並非外來,而是源於細菌染色體的其他部位。接著,在沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)竟然也有類似的單位,可以自由在質體、染色體與噬菌體之間移動,並且傳遞抗藥性。研究人員注意到這些單位的兩側各有一段反向的反覆DNA序列,研究人員就將之命為「轉位子」(transposon)。至此,可移動遺傳因子或跳躍基因的存在引發了研究的熱潮。學者也注意到這種現象不僅在細菌(prokaryote原核生物)存在,其實高等生物也有,而McClintock早在30年前就已著手研究。1976年在冷泉港的會議上,終於有人直接引用McClintock的研究來佐證轉位因子的存在。其後在酵母菌、果蠅中都發現轉位因子的存在。至此McClintock的心血終於獲得接納。1983年她也獨得諾貝爾生理醫學獎,可謂遲來的肯定(圖十三)

走筆至此,讀者可能奇怪我何以長篇累牘地描述McClintock的研究生涯。也許是因為筆者從事遺傳學的工作,如同McClintock也是由染色體的觀察開始,McClintock與染色體對照的是玉米的性狀,筆者對照的是人的性狀。由於兩者都是形態的描述,在講求數字,追求分子生物學的大環境下,筆者也遭遇類似的困難,大家覺得從事「眼睛」看得見的染色體及人類性狀比不上去做「眼睛」看不見的分子來得吃香,於是筆者決定兩者都來既做眼睛看得見的染色體,人類性狀(其實就是病徵)也做眼睛看不見的分子生物學、發育生物學。最近筆者在觀察染色體的時候,也開始能與基因連上關係。例如人類六號染色體的短臂有一處相當大的淺色帶(light band)就像一雙大眼睛,我們教學生辨認六號染色體的要領就是B group裡有大眼睛的那一條。這對大眼睛其實就是6p21.3。此處是MHCmajor histocompatibility complexgene cluster所在之處。由於這個3.6Mb的區段內,基因密度高達43 gene/Mb6號染色體平均度為9.2 gene/Mb),可說非常gene richG+C很高,因此,呈現出極明顯的淺色帶。此區段的HLA-B基因是人類基因體上最具多形性的區段(86 SNP/kb)。在Acrocentric Chromosome1314152122)的短臂頂端有所謂衛星(satellite),就像一個人頭上插了兩朵花,這些衛星其實就是ribosome gene cluster的所在。以這樣的眼光看染色體就像McClintock看到斑彩玉米株就看到環狀染色體。McClintock說「如果你仔細去觀察,每一個生物都會向你透露出她的秘密」。它會告訴你很多它為了調節基因表現而進化出來的機制。她告訴學生「多花時間、多看」。她要學生隨時注意看似一目了然的系統背後隱藏的複雜性(complexity)。

十九世紀末以前,生物學注重「觀察」。生物學家用紀錄及敘述來捕捉自然的奧秘,而不用理論。二十世紀初期,生物學漸漸轉型為一門實驗科學,但仍有像McClintock這樣的學者執著於對生物整體的興趣,重視自然界豐富的多元性。1940年代分子生物學崛起之後,生物學早期觀察「自然」的傳統幾乎斷絕。現代的生物學不再是研究活生生的「生物體」,甚至活機器的科學,而是探討生物體內分子活動的科學,至於生物本身性狀的變化則無人理會,這也許是解析主義(reductionism)的極致,但可能也失去了McClintock從玉米的斑彩變化探究出「轉位」現象的那種能力。現在很多實驗室專門用某些細胞株去研究某些細胞功能如proliferationapoptosis angiogenesis…signaling pathwary,但是從來沒有想過這些東西對生物的性狀到底有什麼影響?不同的實驗往往只是不同的細胞,不同細胞功能,不同signaling pathwary的組合,雖然產生不少論文及博士但往往牛角尖愈鑽愈深。我想這是臺灣生物醫學研究的危機。我常常告訴一些優秀的年輕學者,要從“small biology”進到“big biology”。什麼是big biology呢?我想McClintock對玉米的研究就是big biology,從生物體整體性狀,染色體變化到基因功能的全面關照就是big biology。說得具體一點,每個生物醫學研究者都該熟悉一種或多種的模式生物系統,從它的性狀(gross appearance)到染色體到基因功能可以嫻熟掌握,再以之印證實驗室中的某個概念,才是生物醫學研究可長可久之計,也就是遵循Krogh´s principle

至於臨床醫學更是如此,許多人言必稱基因,但卻不仔細觀察clinical phenotypelaboratory phenotype。每一個臨床表徵,每一個檢驗數據,每一張醫學影像其實是許多基因活動(gene activities)的組合,端視你有沒有能力去解析,所謂「內行看門道,外行看熱鬧」。臺大一位前輩病理教授-陳海青老師,在帶領我們看病理切片的時候,常說我看病理切片,就像在看電影。我們不可能「視病猶親」但絕對要「視病猶師」。

 最後,我們要學習的可能是McClintock對玉米投下的深厚感情。這份感情化成一股動力,使她能面對漫長的工作,嚴酷的考驗;還有她對自然界深深敬意與關愛,這可以說是一種「宗教感」,也可以說是與「大自然的戀愛」。當然她對於自己不同於當時中心教條(central dogma-基因是固定不變的)的研究結果,勇於堅持,直言不諱的執著也是最難能可貴的。她認為所謂正規、熱門的科學方法,並不見得能帶來真理,也非追求知識的唯一途徑。

這幾年複雜體系(complex system),複雜性(complexity),系統生物學(systems biology)等字眼漸漸地出現在科學期刊上,經過一個多世紀的解析主義(reductionism)之後,科學家終於意識到必須像McClintock一樣結合巨觀與微察的追尋,才能揭開自然的奧秘。McClintock的故事也提示了在基因體研究上染色體的重要性,基因不是孤懸在空中,而是染色體的一部分。基因的功能有賴於染色體的調控,要了解基因必須先了解染色體。希望讀者也像McClintock一樣熟悉細胞遺傳學cytogenetics

最後,筆者要感謝玉米田裡的先知一書的譯者與出版者,能夠把這本相當冷門但對生物醫學研究者充滿莫大啟示的書呈現在臺灣人的面前。由於手中沒有原著,為了傳神,本文中許多地方直接引用了譯者的文句。不過讀者最好能自己仔細地閱讀全書,必然更能心領神會(圖十四)

 

 

取材文獻

1. Evelyn Fox KellerA feeling for the organismThe life and work of Barbara McClintock W.H Freeman & Company 1983ISBN 0-7167-1504-X

2. 唐嘉慧玉米田裡的先知異類遺傳學家麥克林托克,台北, 天下文化, 1995

3. Robert H. TamarinPrinciple of geneticsNew York, McGraw Hill, p425, 2001.