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閒話基因體科學_4.細胞核內,彩雲朵朵—基因體之立體空間結構
by 陳怡蓁, 2012-08-21 13:25, Views(1006)

細胞核內,彩雲朵朵

基因體之立體空間結構

 

臺大醫學院 謝豐舟教授

 

所有的基因都存在於染色體上,基因的功能受到其在染色體上之位置與環境的調控。要瞭解基因的功能有必要瞭解基因和染色體在細胞核內的空間結構。我們平常所見的染色體影像是metaphase的情況(圖一)。事實上,在細胞週期內,大部分時間細胞是處於interphase,也就是說gene activity是在interphase時而非在metaphase時,因此我們必需探討在interphase時,細胞核內的染色體到底是以什麼樣的狀態存在呢?

人類的DNA序列長達2公尺,這2公尺長的DNA序列如何擠在大小僅10μm的微小細胞核裡呢?由於技術上的困難,學者一直無法好好地探究這個問題以致眾說紛紜。目前大家同意的是,interphase時染色體在細胞核內的分佈是(1)非隨機的(non-random),(2)各別的染色體有其自己分佈的領域(Chromosome territory)。

 

.基因體的3D結構

且讓我們先以原核生物的細菌來探討。細菌沒有細胞核,其染色體形成圈狀(loop)的核樣體(nucleoid)。當轉錄進行時,核樣體上的聚合酶(polymerase)會彼此聚集(aggregation),使核樣體拉成星狀,加上轉錄產生的RNA形成一個自我維持(self-sustaining)的結構(圖二)。在真核生物的細胞核,DNA纏繞著histone形成nucleosomenucleosome彼此連接成線。這些線經由transcription factors以及polymerase連結於位於中央的factory。連結點之間游離的DNA線條形成長度約86kb5-200 kb)的loop。每一個factory大概附著著1020DNA loop,這相當於前述細菌的nucleoid。一個factory以及附著其上的1020loop,加上所形成的轉錄產物形成類似雲狀(cloud)的結構。每一條染色體上隨時有50200個雲狀結構,整體就構成所謂的“chromosome territory”。一般一個雲狀結構內只有一種polymeraseⅠ、Ⅱor(圖三)

在一個factory裡面,polymerase是固定的,而DNA loop則是活動的。當DNA loop上的某個基因要進行轉錄時,此一基因的DNA序列才會靠近固定的polymerase,與之連結進行轉錄。當轉錄工作完成,該基因之DNA序列

就脫離固定的polymerase而變成游離loop的一部份。此一結構模式與「DNA序列是固定的,而polymerase是活動的」的傳統觀念大相逕庭,但目前「polymerase是固定的」的說法似乎漸獲支持。因此,這整個結構模式的基本概念是「染色體的結構是靠轉錄功能來維持」,也就是說「功能決定結構」,亦即基因體的結構是取決於其轉錄(transcription)功能。

 

.基因體空間結構的原則

基因體在極微小的細胞核空間如何自處,似乎遵循著下列原則:

1. DNA序列中就存有共通(universally recognizable的結構資訊

細菌以及yeastDNA片段可以正確無誤的嵌合到哺乳類細胞的DNA(包括interphasemetaphase)。這表示不同物種的DNA序列就帶有共通的結構資訊才能彼此正確無誤地互相接納。

2. 基因體具有自我組構(self-organization)的能力

巨分子彼此之間的互動有二種模式:(1)自我集合(self-assembly(2)自我組構(self-organization)。自我集合是巨分子形成一穩定的靜態結構(如viral particle)而自我組構則是巨分子形成一動態結構,此一結構與周遭的巨分子隨時彼此互動構成一個動態平衡,隨著需要,執行不同的功能,也形成不同的結構。若將tubulin, microtubule motorsATP混合,在不同的相對濃度可以分別形成random networkvorticesaster form三種形態。當相對濃度稍有改變時,立即發生形態的改變。因此,基因體的結構是取決於transcriptional activity的一個動態的自我組構(self-organization)。換句話說,由於基因體的動態結構,一個特定基因的位置並非固定,而取決於當時基因體的transcriptional activity

3. 分子的擁擠(crowding)會促進聚集(aggregation

細胞核中的各種巨分子極度擁擠,濃度高達0.10.4 gm/ml。我們已知分子的擁擠會影響其有效濃度、平衡常數以及反應速率。即使濃度相同,巨大分子的有效濃度比小分子更高。在紅血球中,血色素的有效濃度比其真正濃度(0.3 gm/ml)高達100倍。而有效濃度的提高(亦即更為擁擠)進一步會影響反應的平衡。例如在紅血球的擁擠環境下,一個100 KD大小的球形蛋白進行reversible dimerization的速率比在稀釋情況下高出100倍。在稀釋等張溶液中DNApolymerase DNADNA binding proteinHU protein, histone)就發會發生聚集。在細胞核內巨分子極度擁擠的情況下,聚集的程度當然更大大地增加。

因此在細胞核中,染色體上各transcriptional complex在巨分子極度擁擠的情況下,當然會發生聚集而使整個基因體彎曲折疊,形成結構。當transcription完全停止時,整個基因體的巨分子則會極度聚集,形成最小的體積(collapse)

4. 基因體結構有賴於轉錄的持續進行

在活的細菌中,核樣體(nucleoid)一般集中於細胞的內部,使用rifampicin抑制轉錄時,核樣體會分散到細胞四處。在真核細胞中本來位於特定territoryor nucleoli or chromocenters)的DNA序列,在加入可抑制mRNA合成的DRB之後,就會散開。

5. Polymerase群集形成DNA loop

傳統的觀念,認為RNA polymerase是活動的,polymeraseDNA序列移動合成mRNA,但最近的研究顯示polymerase是固定的,而DNA序列是活動的。當特定的DNA序列要進行轉錄時就會靠近polymerase,與之連結開始轉錄工作,當轉錄工作完成,就離開polymerase而變成游離的loop。這個有違傳統的模式似乎難為大家接受,但證據顯示polymerase在固定狀態也可以同樣有效地進行轉錄,更重要的是,只有在polymerase固定的狀態下轉錄出來的mRNA才能自由地脫離polymerase進入細胞質。

Polymerase之間彼此聚集更進一步確保在周遭中polymerasepromoter的濃度更形提高,有助於轉錄工作的進行。

6. Repeated rRNA的轉錄會影響染色體的位置

部分人類染色體帶有Nucleolar Organizing RegionsNOR),如131415NOR上有45S rRNA gene之叢集(clustering)。染色體完成mitosis開始解濃縮(decondense)。當一個染色體NOR45S rRNA gene開始轉錄工作時,可能會與其他染色體的NOR相碰撞,而使彼此的promoter互相作用,進而使兩個NOR合成為一個transcriptional factory。而這兩個染色體整體也被拉至相近的位置。這是一個基因體上功能產生結構,而此結構更促進功能的例子。

7. 轉錄可以促使homologous chromosome彼此配對

metaphase染色體形成時,一般其轉錄工作停止,但同源染色體配對時卻有active transcription。在meiosis研究上發現,meiosis時同源染色體發生配對的DNA序列是promoter,而promotercopy number越多,配對愈強。在體細胞內同源染色體也會配對,配對的程度與該生物體基因體的複雜度相反。在yeast中最明顯,人類則罕見。如前所述,染色體上有許多成為雲狀的factory在進行轉錄,由於兩條同源染色體通常共存於同一染色體線條(string),因此彼此遭遇的機會相當大。當一條染色體上某一個雲狀的factory與其同源染色體的factory接觸時,若其中有相同功能的promoter則彼此就會互相進行轉錄,如此就造成兩個同源染色體的配對。這也是轉錄影響染色體位置的一例。

8. 轉錄功能停止會影響染色體位置

當轉錄功能停止時,nucleosome會聚集成heterochromatin,而heterochromatin之中心粒會移動到細胞核膜邊上的lamina而其telomere則接近nucleolus

以上的基因體立體空間結構原則許多仍為推論,將來經由以下的研究也許有助於進一步釐清基因體的3D結構。

1. 由基因體序列充分掌握所有的transcription units。因為transcription決定structure,所以掌握transcription units有助於了解基因體的3D結構。

2. 使用GFP-tagged polymerase將有助於看見活細胞中的transcription factory

3. 使用「chromosome conformation captureassay有助於探討特定基因之間的距離。

4. 單一細胞的基因表現分析將有助於了解其轉錄情況並進而探討轉錄與結構的關係。

 

.細胞核內染色體的空間分佈

Interphase時細胞核內染色體的空間分佈位置可分為:1. radial positioning2. relative positioning

1. radial positioning一般而言,gene-dense染色體的位置較接近細胞核中心,而gene-poor染色體則較接近細胞核的邊緣。此一分佈傾向在淋巴細胞與纖維母細胞均是演化上高度保留。會影響radial positioning的還有染色體的大小,甚至在各別基因,其radial position也有一定的傾向。

2. relative positioning:某些染色體有群聚在一起的傾向。例如小鼠的淋巴球細胞121415號染色體的兩個同源染色體之一常常會群集在一處。而一個細胞核中只有一個群集,而非兩個,顯示父源與母源染色體的位置可能不同。

事實上一個染色體的radial positioningrelative positioning兩者可以互相影響,決定一個染色體的位置。Interphase時各別染色體的位置其實相當穩定。除了在G1 phase早期染色體有較大的位移之外,細胞周期的其他時間,染色體及基因座的移動範圍侷限於1μm之內。

1. 基因表現狀態與其位置之關係

一般而言,有下列三個觀察:

1.活動的基因比不活動者接近細胞核的中心。

2.活動的基因通常會位在chromosome territory外圍的loop

3.活動的基因通常離中心粒較遠。

然而,這些原則並不經常適用。事實上到目前為止,我們還不能找出基因活動性與其位置之間的明確關連。以T cell為例,在其分化過程中,在CD4+ CD8+的階段,CD4 locus是處於細胞核中心與細胞核膜的中間點。當分化成CD8+細胞時,CD4 locus就移到細胞核邊緣,而在CD4+細胞,它卻是移動到細胞核中心。至於CD8 locus不管在CD4+CD8+CD8+細胞(active state)或是在CD4+細胞(inactive state)其radial position均無變動。

2. 癌細胞核內之染色體位置

最近許多研究顯示當兩條染色體發生斷裂時,其斷裂發生轉位(trans location)的機會與兩者原本在細胞核內的接近程度相關。以最著名的Philadelphia chromosome922轉位為例:在正常細胞的細胞核,922染色體均位於細胞核中心附近,而ABLBCR gene也彼此甚為接近。在acute promyelocytic leukemia常發生fusionPMLRARα genehematopoietic precursor細胞核的間距比在B細胞為短。ABL-BCR gene的間距在early granulocytic precursor也比在成熟granulocyte為短。這些研究表示在許多腫瘤,染色體之間轉位的發生與其彼此的空間位置有關。在yeast及哺乳類的研究也顯示斷裂的染色體並不會有太大的移動空間,因此只有鄰近者才能發生轉位。更進一步的研究顯示在Burkitt’s lymphomaMYC geneIGHIGLIGK基因會發生彼此轉位,而不同轉位發生的頻率取決於MYC geneIGHIGLIGK基因的間距、位置及配對情況。在小鼠的B-cell lymphoma常見121415染色體之轉位,事實上在正常淋巴球細胞這三個染色體就常群集在一起,形成packed cluster。在放射線引起的甲狀腺腫瘤常見RET-H4 gene fusion,雖然兩者相距30MB,但在細胞核內卻極為接近。這顯示在Interphase細胞核內兩者所在的DNA loop會相互接近。

在不同的細胞類別,或不同的分化階段,前述的情況是否適用並不清楚,但希望將來由interphase細胞核內的基因或染色體位置可以做為診斷疾病的指標。

總結而言,基因體空間的結構的機制有二(圖四)

1. 自我組構(self-organization):

細胞核內的基因體因transcription而形成動能的結構。

2. 細胞核內的結構元素(architectural elements

細胞核內的nuclear matrix或某些protein甚至RNA可能形成一些結構而染色體附著於其上。最近的研究顯示SATB1蛋白質在細胞核內形成networkthymocyte specific的細胞核結構元素(圖五)

其他與基因體結構有關的角色還有:

1. Centromeretelomere

Centromere彼此有聚集的傾向,而telomere則傾向於接近細胞核膜,這些聚集可能與Silencing factory有關。

2. Nuclear lamina之功能

染色體會與細胞核膜內緣的lamina互動。Lamina是由lamin A. B. C.組成,最近發現lamin gene突變會引起muscular dystrophy以及premature agingHutchinson-Gilford Progeria Syndrome)顯示lamin可能有控制基因表現的功能,這也許與lamin對基因體空間結構的影響有關。

3. 細胞核內次級空間(Subcompartment)之存在

在哺乳類細胞某些基因會與細胞核內的物體有所關連。例如histone geneU2 gene會與Cajal body相近,染色體67會形成OPT domains,染色體91215之上會有heat shock granulesPML body則會與其target gene相近。

4. pre-mRNA splicing factor可能形成次級空間

此空間常有gene richR-band圍繞,所以splicing factory可能形成細胞核的次級空間。

5. tissue specificity會影響基因體的空間結構

最近Parada等人以2D3D FISH研究發現,小鼠的染色體分佈呈現tissue- specific pattern甚至translocation的發生亦有tissue specificity

 

結論:

絕大部分基因功能的執行是在interphase,而基因功能與其在染色體上的位置及染色體的狀況有非常重要的關係。因此,要了解基因功能,必需先探討到底interphase時基因體在細胞核內的空間立體結構。本文將目前這方面已知的資訊做一整理,但這方面的研究顯然才剛起步。對基因體3D結構的了解仍有待更多的努力。

本文由楊濬光醫師協助完稿

 

 

取材文獻

1. Cook RPPredicting three-dimensional genome structure from transcriptional activity Nature Genetics 32347, Nov. 2002.

2. Parada LA et alSpatial genome organization Experimental Cell Research296:64, 2004.

3. Parada LA et alTissue-specific spatial organization of genome. Genome Biol 5(7) :R44, 2004.

4. http://genomebiology.com/2004/5/7/R44/?mkt=26225